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首頁 > 技術與支持 > 高壓液相色譜(HPLC)系統組成

高壓液相色譜(HPLC)系統組成

點擊次數:3555 發布時間:2010-02-26
HPLC系統一般由輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、數據記錄及處理裝置等組成。其中輸液泵、色譜柱、檢測器是關鍵部件。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機、自動進樣器、預柱或保護柱、柱溫控制器等,現代HPLC儀還有微機控制系統,進行自動化儀器控制和數據處理。制備型HPLC儀還備有自動餾分收集裝置。

   
zui早的液相色譜儀由粗糙的高壓泵、低效的柱、固定波長的檢測器、繪圖儀,繪出的峰是通過手工測量計算峰面積。后來的高壓泵精度很高并可編程進行梯度洗脫,柱填料從單一品種發展至幾百種類型,檢測器從單波長至可變波長檢測器、可得三維色譜圖的二極管陣列檢測器、可確證物質結構的質譜檢測器。數據處理不再用繪圖儀,逐漸取而代之的是zui簡單的積分儀、計算機、工作站及網絡處理系統。
一、輸液泵
1.泵的構造和性能
   
輸液泵是HPLC系統中zui重要的部件之一。泵的性能好壞直接影響到整個系統的質量和分析結果的可靠性。輸液泵應具備如下性能:①流量穩定,其RSD應<0.5%,這對定性定量的準確性至關重要;②流量范圍寬,分析型應在0.1~10
ml/min范圍內連續可調,制備型應能達到100 ml/min;③輸出壓力高,一般應能達到150~300kg/cm2;④液缸容積小;⑤密封性能好,耐腐蝕。
   
泵的種類很多,按輸液性質可分為恒壓泵和恒流泵。恒流泵按結構又可分為螺旋注射泵、柱塞往復泵和隔膜往復泵。恒壓泵受柱阻影響,流量不穩定;螺旋泵缸體太大,這兩種泵已被淘汰。目前應用zui多的是柱塞往復泵。

   
柱塞往復泵的液缸容積小,可至0.1ml,因此易于清洗和更換流動相,特別適合于再循環和梯度洗脫;改變電機轉速能方便地調節流量,流量不受柱阻影響;泵壓可達400kg/cm2。其主要缺點是輸出的脈沖性較大,現多采用雙泵系統來克服。雙泵按連接方式可分為并聯式和串聯式,一般說來并聯泵的流量重現性較好(RSD為0.1%左右,串聯泵為0.2~0.3%),但出故障的機會較多(因多一單向閥),價格也較貴。

2.泵的使用和維護注意事項
    為了延長泵的使用壽命和維持其輸液的穩定性,必須按照下列注意事項進行操作:
   
①防止任何固體微粒進入泵體,因為塵埃或其它任何雜質微粒都會磨損柱塞、密封環、缸體和單向閥,因此應預先除去流動相中的任何固體微粒。流動相在玻璃容器內蒸餾,而常用的方法是濾過,可采用Millipore濾膜(0.2&micro;m或0.45&micro;m)等濾器。泵的入口都應連接砂濾棒(或片)。輸液泵的濾器應經常清洗或更換。

   
②流動相不應含有任何腐蝕性物質,含有緩沖液的流動相不應保留在泵內,尤其是在停泵過夜或更長時間的情況下。如果將含緩沖液的流動相留在泵內,由于蒸發或泄漏,甚至只是由于溶液的靜置,就可能析出鹽的微細晶體,這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環和柱塞等。因此,必須泵入純水將泵充分清洗后,再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護的溶劑(對于反相鍵合硅膠固定相,可以是甲醇或甲醇-水)。

    ③泵工作時要留心防止溶劑瓶內的流動相被用完,否則空泵運轉也會磨損柱塞、缸體或密封環,zui終產生漏液。
    ④輸液泵的工作壓力決不要超過規定的zui高壓力,否則會使高壓密封環變形,產生漏液。
    ⑤流動相應該先脫氣,以免在泵內產生氣泡,影響流量的穩定性,如果有大量氣泡,泵就無法正常工作。
如果輸液泵產生故障,須查明原因,采取相應措施排除故障:
   
①沒有流動相流出,又無壓力指示。原因可能是泵內有大量氣體,這時可打開泄壓閥,使泵在較大流量(如5ml/min)下運轉,將氣泡排盡,也可用一個50ml針筒在泵出口處幫助抽出氣體。另一個可能原因是密封環磨損,需更換。

   
②壓力和流量不穩。原因可能是氣泡,需要排除;或者是單向閥內有異物,可卸下單向閥,浸入丙酮內超聲清洗。有時可能是砂濾棒內有氣泡,或被鹽的微細晶粒或滋生的微生物部分堵塞,這時,可卸下砂濾棒浸入流動相內超聲除氣泡,或將砂濾棒浸入稀酸(如4mol/L硝酸)內迅速除去微生物,或將鹽溶解,再立即清洗。

    ③壓力過高的原因是管路被堵塞,需要清除和清洗。壓力降低的原因則可能是管路有泄漏。檢查堵塞或泄漏時應逐段進行。
3.梯度洗脫
   
HPLC有等強度(isocratic)和梯度(gradient)洗脫兩種方式。等度洗脫是在同一分析周期內流動相組成保持恒定,適合于組分數目較少,性質差別不大的樣品。梯度洗脫是在一個分析周期內程序控制流動相的組成,如溶劑的極性、離子強度和pH值等,用于分析組分數目多、性質差異較大的復雜樣品。采用梯度洗脫可以縮短分析時間,提高分離度,改善峰形,提高檢測靈敏度,但是常常引起基線漂移和降低重現性。

    梯度洗脫有兩種實現方式:低壓梯度(外梯度)和高壓梯度(內梯度)。
    兩種溶劑組成的梯度洗脫可按任意程度混合,即有多種洗脫曲線:線性梯度、凹形梯度、凸形梯度和階梯形梯度。線性梯度zui常用,尤其適合于在反相柱上進行梯度洗脫。
    在進行梯度洗脫時,由于多種溶劑混合,而且組成不斷變化,因此帶來一些特殊問題,必須充分重視:
   
①要注意溶劑的互溶性,不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相。有些溶劑在一定比例內混溶,超出范圍后就不互溶,使用時更要引起注意。當有機溶劑和緩沖液混合時,還可能析出鹽的晶體,尤其使用磷酸鹽時需特別小心。

   
②梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高,以保證良好的重現性。進行樣品分析前必須進行空白梯度洗脫,以辨認溶劑雜質峰,因為弱溶劑中的雜質富集在色譜柱頭后會被強溶劑洗脫下來。用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣,以防止混合時產生氣泡。

   
③混合溶劑的粘度常隨組成而變化,因而在梯度洗脫時常出現壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小,當二者以相近比例混合時粘度增大很多,此時的柱壓大約是甲醇或水為流動相時的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱能承受的zui大壓力。

    ④每次梯度洗脫之后必須對色譜柱進行再生處理,使其恢復到初始狀態。需讓10~30倍柱容積的初始流動相流經色譜柱,使固定相與初始流動相達到完全平衡。
二、進樣器
   
早期使用隔膜和停流進樣器,裝在色譜柱入口處。現在大都使用六通進樣閥或自動進樣器。進樣裝置要求:密封性好,死體積小,重復性好,保證中心進樣,進樣時對色譜系統的壓力、流量影響小。HPLC進樣方式可分為:隔膜進樣、停流進樣、閥進樣、自動進樣。

1.隔膜進樣。用微量注射器將樣品注入專門設計的與色譜柱相連的進樣頭內,可把樣品直接送到柱頭填充床的中心,死體積幾乎等于零,可以獲得*的柱效,且價格便宜,操作方便。但不能在高壓下使用(如10MPa以上);此外隔膜容易吸附樣品產生記憶效應,使進樣重復性只能達到1~2%;加之能耐各種溶劑的橡皮不易找到,常規分析使用受到限制。

2.停流進樣。可避免在高壓下進樣。但在HPLC中由于隔膜的污染,停泵或重新啟動時往往會出現"鬼峰";另一缺點是保留時間不準。在以峰的始末信號控制餾分收集的制備色譜中,效果較好。

3.閥進樣。一般HPLC分析常用六通進樣閥(以美國Rheodyne公司的7725和7725i型zui常見),其關鍵部件由圓形密封墊(轉子)和固定底座(定子)組成。由于閥接頭和連接管死體積的存在,柱效率低于隔膜進樣(約下降5~10%左右),但耐高壓(35~40MPa),進樣量準確,重復性好(0.5%),操作方便。

   
六通閥的進樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。①用部分裝液法進樣時,進樣量應不大于定量環體積的50%(zui多75%),并要求每次進樣體積準確、相同。此法進樣的準確度和重復性決定于注射器取樣的熟練程度,而且易產生由進樣引起的峰展寬。②用完全裝液法進樣時,進樣量應不小于定量環體積的5~10倍(zui少3倍),這樣才能完全置換定量環內的流動相,消除管壁效應,確保進樣的準確度及重復性。

   
六通閥使用和維護注意事項:①樣品溶液進樣前必須用0.45&micro;m濾膜過濾,以減少微粒對進樣閥的磨損。②轉動閥芯時不能太慢,更不能停留在中間位置,否則流動相受阻,使泵內壓力劇增,甚至超過泵的zui大壓力;再轉到進樣位時,過高的壓力將使柱頭損壞。③為防止緩沖鹽和樣品殘留在進樣閥中,每次分析結束后應沖洗進樣閥。通常可用水沖洗,或先用能溶解樣品的溶劑沖洗,再用水沖洗。

4.自動進樣。用于大量樣品的常規分析。
三、色譜柱
   
色譜是一種分離分析手段,分離是核心,因此擔負分離作用的色譜柱是色譜系統的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好,分析速度快等。市售的用于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質的鍵合相、氧化鋁、有機聚合物微球(包括離子交換樹脂)、多孔碳等,其粒度一般為3,5,7,10μm等,柱效理論值可達5~16萬/米。對于一般的分析只需5000塔板數的柱效;對于同系物分析,只要500即可;對于較難分離物質對則可采用高達2萬的柱子,因此一般10~30cm左右的柱長就能滿足復雜混合物分析的需要。

   
柱效受柱內外因素影響,為使色譜柱達到*效率,除柱外死體積要小外,還要有合理的柱結構(盡可能減少填充床以外的死體積)及裝填技術。即使的裝填技術,在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的,靠近管壁的部位比較疏松,易產生溝流,流速較快,影響沖洗劑的流形,使譜帶加寬,這就是管壁效應。這種管壁區大約是從管壁向內算起30倍粒徑的厚度。在一般的液相色譜系統中,柱外效應對柱效的影響遠遠大于管壁效應。

1.柱的構造
    色譜柱由柱管、壓帽、卡套(密封環)、篩板(濾片)、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成,壓力不高于70
kg/cm2時,也可采用厚壁玻璃或石英管,管內壁要求有很高的光潔度。為提高柱效,減小管壁效應,不銹鋼柱內壁多經過拋光。也有人在不銹鋼柱內壁涂敷氟塑料以提高內壁的光潔度,其效果與拋光相同。還有使用熔融硅或玻璃襯里的,用于細管柱。色譜柱兩端的柱接頭內裝有篩板,是燒結不銹鋼或鈦合金,孔徑0.2~20&micro;m(5~10&micro;m),取決于填料粒度,目的是防止填料漏出。

   
色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類,尺寸規格也不同:①常規分析柱(常量柱),內徑2~5mm(常用4.6mm,國內有4mm和5mm),柱長10~30cm;②窄徑柱(narrow
bore,又稱細管徑柱、半微柱semi-microcolumn),內徑1~2mm,柱長10~20cm;③毛細管柱(又稱微柱microcolumn),內徑0.2~0.5mm;④半制備柱,內徑>5mm;⑤實驗室制備柱,內徑20~40mm,柱長10~30cm;⑥生產制備柱內徑可達幾十厘米。柱內徑一般是根據柱長、填料粒徑和折合流速來確定,目的是為了避免管壁效應。

2.柱的發展方向
   
因強調分析速度而發展出短柱,柱長3~10cm,填料粒徑2~3&micro;m。為提高分析靈敏度,與質譜(MS)聯接,而發展出窄徑柱、毛細管柱和內徑小于0.2mm的微徑柱(microbore)。細管徑柱的優點是:①節省流動相;②靈敏度增加;③樣品量少;④能使用長柱達到高分離度;⑤容易控制柱溫;⑥易于實現LC-MS聯用。

   
但由于柱體積越來越小,柱外效應的影響就更加顯著,需要更小池體積的檢測器(甚至采用柱上檢測),更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設備應具備如下性能:輸液泵能精密輸出1~100&micro;l/min的低流量,進樣閥能準確、重復地進樣微小體積的樣品。且因上樣量小,要求高靈敏度的檢測器,電化學檢測器和質譜儀在這方面具有突出優點。

3.柱的填充和性能評價
   
色譜柱的性能除了與固定相性能有關外,還與填充技術有關。在正常條件下,填料粒度>20&micro;m時,干法填充制備柱較為合適;顆粒<20&micro;m時,濕法填充較為理想。填充方法一般有4種:①高壓勻漿法,多用于分析柱和小規模制備柱的填充;②徑向加壓法,Waters;③軸向加壓法,主要用于裝填大直徑柱;④干法。柱填充的技術性很強,大多數實驗室使用已填充好的商品柱。

    必須指出,液相色譜柱的獲得,裝填技術是重要環節,但根本問題還在于填料本身性能的優劣,以及配套的色譜儀系統的的結構是否合理。
   
無論是自己裝填的還是購買的色譜柱,使用前都要對其性能進行考察,使用期間或放置一段時間后也要重新檢查。柱性能指標包括在一定實驗條件下(樣品、流動相、流速、溫度)下的柱壓、理論塔板高度和塔板數、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重復性,或分離度。一般說來容量因子和選擇性因子的重復性在±5%或±10%以內。進行柱效比較時,還要注意柱外效應是否有變化。

    一份合格的色譜柱評價報告應給出柱的基本參數,如柱長、內徑、填料的種類、粒度、色譜柱的柱效、不對稱度和柱壓降等。
4.柱的使用和維護注意事項
    色譜柱的正確使用和維護十分重要,稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中,需要注意下列問題,以維護色譜柱。
   
① 避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內的填充狀況;柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內填料,因此在調節流速時應該緩慢進行,在閥進樣時閥的轉動不能過緩(如前所述)。

    ② 應逐漸改變溶劑的組成,特別是反相色譜中,不應直接從有機溶劑改變為全部是水,反之亦然。
    ③ 一般說來色譜柱不能反沖,只有生產者指明該柱可以反沖時,才可以反沖除去留在柱頭的雜質。否則反沖會迅速降低柱效。
   
④ 選擇使用適宜的流動相(尤其是pH),以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一預柱,分析柱是鍵合硅膠時,預柱為硅膠,可使流動相在進入分析柱之前預先被硅膠"飽和",避免分析柱中的硅膠基質被溶解。

   
⑤ 避免將基質復雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內,需要對樣品進行預處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應該經常更換。

   
⑥ 經常用強溶劑沖洗色譜柱,清除保留在柱內的雜質。在進行清洗時,對流路系統中流動相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過渡,每種流動相的體積應是柱體積的20倍左右,即常規分析需要50~75ml。

   
下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序,作為參考:硅膠柱以正已烷(或庚烷)、二氯甲烷和甲醇依次沖洗,然后再以相反順序依次沖洗,所有溶劑都必須嚴格脫水。甲醇能洗去殘留的強極性雜質,已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷(或氯仿)依次沖洗,再以相反順序依次沖洗。如果下一步分析用的流動相不含緩沖液,那么可以省略zui后用水沖洗這一步。一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質,在甲醇(乙腈)沖洗時重復注射100~200&micro;l四氫呋喃數次有助于除去強疏水性雜質。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類脂。有時也注射二甲亞砜數次。此外,用乙腈、丙酮和三氟醋酸(0.1%)梯度洗脫能除去蛋白質污染。

   
陽離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗,陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗,除去交換性能強的鹽,然后用水、甲醇、二氯甲烷(除去吸附在固定相表面的有機物)、甲醇、水依次沖洗。

    ⑦ 保存色譜柱時應將柱內充滿乙腈或甲醇,柱接頭要擰緊,防止溶劑揮發干燥。禁止將緩沖溶液留在柱內靜置過夜或更長時間。
   
⑧ 色譜柱使用過程中,如果壓力升高,一種可能是燒結濾片被堵塞,這時應更換濾片或將其取出進行清洗;另一種可能是大分子進入柱內,使柱頭被污染;如果柱效降低或色譜峰變形,則可能柱頭出現塌陷,死體積增大。

在后兩種情況發生時,小心擰開柱接頭,用潔凈小鋼將柱頭填料取出1~2mm高度(注意把被污染填料取凈)再把柱內填料整平。然后用適當溶劑濕潤的固定相(與柱內相同)填滿色譜柱,壓平,再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善,但是很難恢復到新柱的水平。

   
柱子失效通常是柱端部分,在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱(5~30mm),可以起到保護、延長柱壽命的作用。采用保護柱會損失一定的柱效,這是值得的。
   
通常色譜柱壽命在正確使用時可達2年以上。以硅膠為基質的填料,只能在pH2~9范圍內使用。柱子使用一段時間后,可能有一些吸附作用強的物質保留于柱頂,特別是一些有色物質更易看清被吸著在柱頂的填料上。新的色譜柱在使用一段時間后柱頂填料可能塌陷,使柱效下降,這時也可補加填料使柱效恢復。

   
每次工作完后,用洗脫能力強的洗脫液沖洗,例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當采用鹽緩沖溶液作流動相時,使用完后應用無鹽流動相沖洗。含鹵族元素(氟、氯、溴)的化合物可能會腐蝕不銹鋼管道,不宜長期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經常使用,應每隔4~5天開機沖洗15分鐘。

四、檢測器
   
檢測器是HPLC儀的三大關鍵部件之一。其作用是把洗脫液中組分的量轉變為電信號。HPLC的檢測器要求靈敏度高、噪音低(即對溫度、流量等外界變化不敏感)、線性范圍寬、重復性好和適用范圍廣。

1.分類
1)按原理可分為光學檢測器(如紫外、熒光、示差折光、蒸發光散射)、熱學檢測器(如吸附熱)、電化學檢測器(如極譜、庫侖、安培)、電學檢測器(電導、介電常數、壓電石英頻率)、放射性檢測器(閃爍計數、電子捕獲、氦離子化)以及氫火焰離子化檢測器。

2)按測量性質可分為通用型和專屬型(又稱選擇性)。通用型檢測器測量的是一般物質均具有的性質,它對溶劑和溶質組分均有反應,如示差折光、蒸發光散射檢測器。通用型的靈敏度一般比專屬型的低。專屬型檢測器只能檢測某些組分的某一性質,如紫外、熒光檢測器,它們只對有紫外吸收或熒光發射的組分有響應。

3)按檢測方式分為濃度型和質量型。濃度型檢測器的響應與流動相中組分的濃度有關,質量型檢測器的響應與單位時間內通過檢測器的組分的量有關。
4)檢測器還可分為破壞樣品和不破壞樣品的兩種。
2.性能指標
1)噪音和漂移:在儀器穩定之后,記錄基線1小時,基線帶寬為噪音,基線在1小時內的變化為漂移。它們反映檢測器電子元件的穩定性,及其受溫度和電源變化的影響,如果有流動相從色譜柱流入檢測器,那么它們還反映流速(泵的脈動)和溶劑(純度、含有氣泡、固定相流失)的影響。噪音和漂移都會影響測定的準確度,應盡量減小。

2)靈敏度(sensitivity):表示一定量的樣品物質通過檢測器時所給出的信號大小。對濃度型檢測器,它表示單位濃度的樣品所產生的電信號的大小,單位為mV·ml/g。對質量型檢測器,它表示在單位時間內通過檢測器的單位質量的樣品所產生的電信號的大小,單位為mV·s/g。

3)檢測限(detection limit)
    檢測器靈敏度的高低,并不等于它檢測zui小樣品量或zui低樣品濃度能力的高低,因為在定義靈敏度時,沒有考慮噪聲的大小,而檢測限與噪聲的大小是直接有關的。
檢測限指恰好產生可辨別的信號(通常用2倍或3倍噪音表示)時進入檢測器的某組分的量(對濃度型檢測器指在流動相中的濃度--注意與分析方法檢測限的區別,單位g/ml或mg/ml;對質量型檢測器指的是單位時間內進入檢測器的量,單位g/s或mg/s)。又稱為敏感度(detectability)。D=2N/S,式中N為噪聲,S為靈敏度。通常是把一個已知量的標準溶液注入到檢測器中來測定其檢測限的大小。

   
檢測限是檢測器的一個主要性能指標,其數值越小,檢測器性能越好。值得注意的是,分析方法的檢測限除了與檢測器的噪聲和靈敏度有關外,還與色譜條件、色譜柱和泵的穩定性及各種柱外因素引起的峰展寬有關。

4)線性范圍(linear
range):指檢測器的響應信號與組分量成直線關系的范圍,即在固定靈敏度下,zui大與zui小進樣量(濃度型檢測器為組分在流動相中的濃度)之比。也可用響應信號的zui大與zui小的范圍表示,例如Waters
996 PDA檢測器的線性范圍是-0.1~2.0A。
   
定量分析的準確與否,關鍵在于檢測器所產生的信號是否與被測樣品的量始終呈一定的函數關系。輸出信號與樣品量呈線性關系,這樣進行定量測定時既準確又方便。但實際上沒有一臺檢測器能在任何范圍內呈線性響應。通常A=BCx,B為響應因子,當x=1時,為線性響應。對大多數檢測器來說,x只在一定范圍內才接近于1,實際上通常只要x=0.98~1.02就認為它是呈線性的。

   
線性范圍一般可通過實驗確定。我們希望檢測器的線性范圍盡可能大些,能同時測定主成分和痕量成分。此外還要求池體積小,受溫度和流速的影響小,能適合梯度洗脫檢測等。
5)池體積:除制備色譜外,大多數HPLC檢測器的池體積都小于10&micro;l。在使用細管徑柱時,池體積應減少到1~2&micro;l甚至更低,不然檢測系統帶來的峰擴張問題就會很嚴重。而且這時池體、檢測器與色譜柱的連接、接頭等都要精心設計,否則會嚴重影響柱效和靈敏度。

3.紫外檢測器(ultraviolet detector)
   
UV檢測器是HPLC中應用zui廣泛的檢測器,當檢測波長范圍包括可見光時,又稱為紫外-可見檢測器。它靈敏度高,噪音低,線性范圍寬,對流速和溫度均不敏感,可于制備色譜。由于靈敏高,因此既使是那些光吸收小、消光系數低的物質也可用UV檢測器進行微量分析。但要注意流動相中各種溶劑的紫外吸收截止波長。如果溶劑中含有吸光雜質,則會提高背景噪音,降低靈敏度(實際是提高檢測限)。此外,梯度洗脫時,還會產生漂移。

    注:將溶劑裝入1cm的比色皿,以空氣為參比,逐漸降低入射波長,溶劑的吸光度A=1時的波長稱為溶劑的截止波長。也稱極限波長。
   
中國藥典對UV法溶劑的要求是:以空氣為空白,溶劑和吸收池的吸收度在220~240nm范圍內不得超過0.40,在241~250nm范圍內不得過0.20,在251~300nm范圍內不得過0.10,在300nm以上不得過0.05。

   
UV檢測器的工作原理是Lambert-Beer定律,即當一束單色光透過流動池時,若流動相不吸收光,則吸收度A與吸光組分的濃度C和流動池的光徑長度L成正比.
    UV檢測器分為固定波長檢測器、可變波長檢測器和光電二極管陣列檢測器(photodiode array
detector,PDAD)。按光路系統來分,UV檢測器可分為單光路和雙光路兩種。可變波長檢測器又可分單波長(單通道)檢測器和雙波長(雙通道)檢測器。PDAD是80年代出現的一種光學多通道檢測器,它可以對每個洗脫組分進行光譜掃描,經計算機處理后,得到光譜和色譜結合的三維圖譜。其中吸收光譜用于定性(確證是否是單一純物質),色譜用于定量。常用于復雜樣品(如生物樣品、中草藥)的定性定量分析。

4.與檢測器有關的故障及其排除
1)流動池內有氣泡
   
如果有氣泡連續不斷地通過流動池,將使噪音增大,如果氣泡較大,則會在基線上出現許多線狀"峰",這是由于系統內有氣泡,需要對流動相進行充分的除氣,檢查整個色譜系統是否漏氣,再加大流量驅除系統內的氣泡。如果氣泡停留在流動池內,也可能使噪音增大,可采用突然增大流量的辦法除去氣泡(不連接色譜柱);或者啟動輸液泵的同時,用手指緊壓流動池出口,使池內增壓,然后放開。可反復操作數次,但要注意不使壓力增加太多,以免流動池破裂。

2)流動池被污染
   
無論參比池或樣品池被污染,都可能產生噪音或基線漂移。可以使用適當溶劑清洗檢測池,要注意溶劑的互溶性;如果污染嚴重,就需要依次采用1mol/L硝酸、水和新鮮溶劑沖洗,或者取出池體進行清洗、更換窗口。

3)光源燈出現故障
    紫外或熒光檢測器的光源燈使用到極限或者不能正常工作時,可能產生嚴重噪音,基線漂移,出現平頭峰等異常峰,甚至使基線不有回零。這時需要更換光源燈。
4)倒峰
   
倒峰的出現可能是檢測器的極性接反了,改正后即可變成正峰。用示差折光檢測器時,如果組分的折光指數低于流動相的折光指數,也會出現倒峰,這就需要選擇合適的流動相。如果流動相中含有紫外吸收的雜質,使用紫外檢測器時,無吸收的組分就會產生倒峰,因此必須用高純度的溶劑作流動相。在死時間附近的尖銳峰往往是由于進樣時的壓力變化,或者由于樣品溶劑與流動相不同所引起的。

五、數據處理和計算機控制系統
   
早期的HPLC儀器是用記錄儀記錄檢測信號,再手工測量計算。其后,使用積分儀計算并打印出峰高、峰面積和保留時間等參數。80年代后,計算機技術的廣泛應用使HPLC操作更加快速、簡便、準確、精密和自動化,現在已可在互聯網上遠程處理數據。計算機的用途包括三個方面:①采集、處理和分析數據;②控制儀器;③色譜系統優化和專家系統。

六、恒溫裝置
    在HPLC儀中色譜柱及某些檢測器都要求能準確地控制工作環境溫度,柱子的恒溫精度要求在±0.1~0.5℃之間,檢測器的恒溫要求則更高。
   
溫度對溶劑的溶解能力、色譜柱的性能、流動相的粘度都有影響。一般來說,溫度升高,可提高溶質在流動相中的溶解度,從而降低其分配系數K,但對分離選擇性影響不大;還可使流動相的粘度降低,從而改善傳質過程并降低柱壓。但溫度太高易使流動相產生氣泡。 

    色譜柱的不同工作溫度對保留時間、相對保留時間都有影響。在凝膠色譜中使用軟填料時溫度會引起填料結構的變化,對分離有影響;但如使用硬質填料則影響不大。
   
總的說來,在液固吸附色譜法和化學鍵合相色譜法中,溫度對分離的影響并不顯著,通常實驗在室溫下進行操作。在液固色譜中有時將極性物質(如緩沖劑)加入流動相中以調節其分配系數,這時溫度對保留值的影響很大。

   
不同的檢測器對溫度的敏感度不一樣。紫外檢測器一般在溫度波動超過±0.5℃時,就會造成基線漂移起伏。示差折光檢測器的靈敏度和zui小檢出量常取決于溫度控制精度,因此需控制在±0.001℃左右,微吸附熱檢測器也要求在±0.001℃以內。
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