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中藥有效成分常見色譜前處理方法

點擊次數:2112 發布時間:2009-11-23

中藥有效成分常見色譜前處理方法

*步:提取法:   用相應的溶劑使有效成分溶解出來的,溶劑根據有機物的性質來選擇。可以冷浸,如果穩定性允許,為加速溶解的過程,可采用超聲處理,加熱回流(包括索氏提取)。選擇適當的溶劑可以減少雜質。基本原則是能用純的甲、乙醇不用帶水的,能用非極性的不用極性的,因為消除極性雜質一般比非極性的麻煩。根據相似相溶的原則,非極性溶劑溶解的極性物質較少。  蒸餾(多為水蒸氣蒸餾)也較多使用,同時具有提取和一定的分離作用。  某些物質還可以用升華法:樟腦,咖啡堿(178℃以上就能升華而不被分解)等。升華法易產生揮發性的焦油狀物,粘附在升華物上,不易除去,另外,升華不完全,甚至會分解,不能用于含量測定。  

第二步:分離和純化:

1、液液萃取  基本上都是水溶后,用乙酸乙酯、乙醚、氯仿、石油醚等與水不相溶的有機溶劑。一般分析的量較少,微溶于水的物質都可以用液液萃取的方法。通過合適的酸化/堿化步驟,可有效的去除雜質。

2、沉淀  利用重金屬等與待分析物形成絡和物或難溶鹽沉淀而分離,然后再用酸、堿等把它還原出來。鉛鹽常用以沉淀有機酸、氨基酸、蛋白質、粘液質、鞣質、樹脂、酸性皂甙、部分黃酮等。例如含綠原酸的溶液加醋酸鉛溶液,攪拌使沉淀,離心,棄去上清液,沉淀物加5%硫酸溶液,用醋酸乙酯萃取。常用雷氏銨鹽使生成生物堿沉淀析出。橙皮甙、蘆丁、黃芩甙均易溶于堿性溶液,加入酸后可使之沉淀析出。某些蛋白質,可以變溶液的pH值利用其在等電點時溶解度zui小的性質而使之沉淀析出。此外,還可以用明膠、蛋白溶液沉淀鞣質;膽甾醇也常用以沉淀洋地黃皂甙等。

3、析出法:包括鹽析和改變溶劑極性析出。  鹽析法是在水溶液中、加入無機鹽,可使某些成分在水中的溶解度降低沉淀析出,而與水溶性大的雜質分離。常用作鹽析的無機鹽有氯化鈉、硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨等。三七皂甙乙、掌葉防己堿,小檗堿等都可以用種方法。不過,一般分析上是在水溶液中加入一定量的食鹽,再用有機溶劑萃取,例如麻黃堿、苦參堿等水溶性較大的物質。  改變溶劑極性析出是在溶液中加入不同極性的溶劑是物質析出。就像生產中水提醇沉、醇提水沉。   

4、柱色譜法:  常用的固定相有硅膠、氧化鋁、聚酰胺、大孔樹脂、活性炭、硅藻土等。柱色譜法有兩種,是簡單的吸附解吸,理論塔板數相當于一,跟萃取差不多,也可稱富集,例如像現在用得很廣的SPE(solid phase extract)。另外一種則是像色譜Tswett那樣,樣品加在柱上形成一窄帶,然后再分步或連續洗脫。  *種較簡單,活化后,按要求預處理,然后讓樣品溶液通過吸附劑,吸附飽和后,根據不同物質的解吸條件,選擇不同吸脫溶劑吸脫下來。關于SPE小柱的使用這里不介紹了,僅舉一更實際的例子:取天麻細粉5g,加甲醇50ml,水浴加熱回流1小時,過濾,濾液蒸干,殘渣加水30ml溶解,用氯仿萃取2次,每次10ml,棄去氯仿液。水液加熱揮去殘余氯仿,加活性炭(不活化)2g,微沸20分鐘,放冷,加硅藻土1g,攪拌均勻,用濾紙過濾,再以40ml水洗滌殘渣,濾液棄去;殘渣于水浴上干燥半小時,然后置錐形瓶中,加無水乙醇50ml,回流半小時,過濾,濾液濃縮至干,加甲醇1ml使溶解,作為供試品溶液。其實,如果不是含量測定的話,上面的做法可以達到目的。如果是含量測定,那就要用柱子,并確定一下吸附劑的使用量,防止待測物損失。  第二種方法,zui重要的是讓樣品在柱上形成窄帶。我們可以近似的認為,窄帶的高度相當于理論塔板高度,柱長除以理論塔板高度就是理論塔板數了。實際上洗脫時,待測成分在柱上的實際高度不一定等于窄帶的高度。如果用洗脫劑直接溶解樣品,就可以直接上柱了。如果不是的話,就要用一定的吸附劑吸附樣品,在把樣品的溶劑揮干后,在加到柱子。洗脫條件應通過實驗確定,包括洗脫溶劑、洗脫體積、洗脫速度。  根據不同的吸附劑,具體的應用不同: (1)硅膠:硅膠顆粒表面有很多硅醇基。硅膠吸附作用的強弱與硅醇基的含量多少有關。硅醇基能夠通過氫鍵作用吸附水分而降低吸附能力,硅膠的吸附性根據其含水量不同分成多個級別。硅膠的活化:100~110℃時,硅膠表面水分即能被除去;500℃時,硅膠表面的硅醇基脫水縮合轉變為硅氧烷鍵,失去吸附性。硅膠是酸性吸附劑,用于中性或酸性成分分離。不活化的硅膠,可利用分配原理分離色素。硅膠又是一種弱酸性陽離子交換劑,其表面上的硅醇基能釋放弱酸性的氫離子,所以可作為離子交換劑,分離堿性化合物。吸附硅膠柱的洗脫溶劑成很多,從非極性到極性的順序洗脫。 (2)氧化鋁:氧化鋁偏堿堿性,zui適宜用于生物堿類的分離,不宜用于醛、酮、醋、內酯等類型的化合物分離。氧化鋁用水洗至中性,稱為中性氧化鋁,中性氧化鋁適用于酸性成分的分離。氧化鋁用稀硝酸或稀鹽酸處理,可使氧化鋁顆粒表面帶有硝酸根或氯離子,制成酸性氧化鋁,酸性氧化鋁具有離于交換劑的性質。中性氧化鋁使用zui多,柱層析用的中性氧化鋁粒度應在100~200目之間。粒度大,分離效果差:小則洗脫速度慢,縱向擴散。中性氧化鋁的活化與硅膠差不多。中性氧化鋁柱的洗脫溶劑溶劑組成很多,從非極性到極性的順序洗脫。 (3)聚酰胺:尼龍與酰胺類化合物形成的高分子聚合物,分子上有很多酰胺基,可與酚類、酸類、醌類、硝基化合物形成氫鍵。適用于酚性化合物如黃酮的分離。一般聚酰胺不需活化或預處理就可以裝柱。提取液或提取物上柱后,用水洗雜質,用不同比例的醇的水溶液從低濃度到高濃度依次洗脫。 (4)大孔樹脂:具有立體結構的多孔性聚合物,有巨大的比表面積,通過范德華力吸附有機物。以前的大孔樹脂多用汽油等作致孔劑,需要用丙酮加熱回流來預處理,現在可購買純度較高的,使用前只需用甲醇、或乙醇洗滌至洗出液滴在水中不產生白色即可。再生樹脂的方法是,用2%~5%的鹽酸浸泡洗滌,用水洗到中性,然后用5%氫氧化鈉浸泡洗滌,用水洗到中性即可。樹脂含水量70%左右,如不慎樹脂干了,可用乙醇或丙酮浸漬處理,然后再用。按實際情況,酸、堿濃度可增減。大孔樹脂類型很多,zui多用的是D101。多用于皂苷、黃酮、內酯、萜類和色素的分離。提取液或提取物上柱后,用水洗雜質,用不同比例的醇的水溶液從低濃度到高濃度依次洗脫。 (5)活性炭:一般需要先用稀鹽酸洗滌,其次用乙醇洗,再以水洗凈,于80℃干燥后再用。上柱用的活性炭,選用顆粒活注炭,若為活性炭細粉,則需加入適量硅藻土作為助濾劑一并裝柱,以免流速太慢。活性炭主要且于分離水溶性成分。活性炭對芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物,對大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。可將水溶性芳香族物質與脂肪族物質分開,單糖與多糖分開,氨基酸與多肽分開。提取液或提取物上柱后,用水洗雜質,用不同比例的醇的水溶液從低濃度到高濃度依次洗脫。 (6)硅藻土:采用不同pH緩沖液的硅藻土分配色譜柱,可分離生物堿、酸性生物堿和中性物質。提取液或提取物上柱后,用乙醚或氯仿洗下色素、脂肪、中性雜志,然后用胺性醇洗下生物堿。    十八烷基硅烷基硅烷堿合硅膠、其它類型鍵合硅膠、DEAE纖維素、其他纖維素、離子交換樹脂應用的較少,這里略去。

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