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首頁 > 技術與支持 > C18液相色譜柱的使用注意事項及優化條件

C18液相色譜柱的使用注意事項及優化條件

點擊次數:5784 發布時間:2009-10-12

正相、反相和極性膠聯柱使用手冊
注意
此色譜柱填充的是改性硅膠材料。向柱內導入堿性溶劑(pH>7.0)或酸性溶劑(pH<2.0)會導致柱子損壞。在使用這個柱子之前,你要充分地熟悉這本手冊講述的內容。未正確地使用不能享受保修待遇。
簡介
此柱填充的是反相或者極性膠聯型態的硅膠基質材料的硅膠。硅膠形態的柱子用于正相(非水)條件。
反相(C8,C18,ODS,RP-8和RP-18)通常用于反相條件(水相)。
極性膠聯型(APS,diol,CN和NH2)依照應用目的,可以用于正相和反相條件。建議不要將一個相同的柱子用于差別非常大的條件下,這是因為柱子在特定的條件下,固定相的性質會發生變化,所以在其他的條件下,會影響柱效。也不建議將硅膠柱用在反相條件下或者將反相柱用在正相條件下,這是因為這種過程會發生重復性差的問題(每一次注射之間和柱與柱之間的比較)。
色譜柱老化
在開始分析工作以前,柱子必須經過正確的老化。一個沒有正確老化的柱子可能會帶來問題,諸如很差的柱效或者分離情況發生變化等等。
A.在反相條件下老化
要老化這類柱子,首先要使用乙腈或者甲醇淋洗,然后你選用的洗脫液進行平衡。在發貨以前,每根柱子都已經測試過并進行了老化。因此沒有必要在*次使用時用水沖洗)。如果流動相中使用了添加物(例如緩沖液或離子對試劑),建議使用正確比例的但不含此添加物的流動相進行緩沖沖洗。緩沖沖洗應當首先以低流速進行,zui后再使用正常流速。
B.在正相條件下老化
柱效可能會受水與固定相的鍵合的嚴重影響。柱子的干燥(激活)或潤濕(失活)可能是需要的。使用的溶劑可能是水飽和的或者是無水的。干燥柱子可以使用無水的二氯甲烷。
C.對于極性鍵合柱的特殊說明
由于這些柱子可以用于反相或者正相條件,在進行老化以前,一定要首先檢查你要使用的淋洗溶劑或洗脫液是否可以與封裝在柱子里的溶劑相混溶。如果這些溶劑不能混溶,必須先使用一個合適的緩沖溶劑進行沖洗。
洗脫液
注意第1節和第2節。一定不要使用pH低于2或者高于7的緩沖液,這是由于它們會改變固定相的性質。極性鍵合柱使用在3到5 之間。在使用以前,洗脫液要進行脫氣,以及使用0.5微米的濾膜過濾,以免發生檢測和泵送問題。
一定要在開始使用系統以前檢查水溶液中有否微生物生長,否則你的柱子會堵塞,柱壓會升高到無法接受的水平。

流量和壓力
柱內徑(毫米)        流速        (ml/min)        
                  *        zui高        
2.0                0.2        1.0        
3.0              0.4        2.0        
4.6              1.0        4.0        
10.0            4.7        18.0        
注意:zui高壓力:不銹鋼柱:4500psi;玻璃柱:3000psi
增加流速或者降低流速要采取小的間隔變化以防止填充床的擾動。
如果你想更換柱子,要降低流量至0,等待洗脫液完全流出柱子為止(2分鐘)。
拆除柱子而沒有等待壓力的降低會損壞柱子。
高柱壓的產生一般是由于不正確地使用柱子的結果。
使用保護柱(見第6節)會防止污染物沉積在分析柱上。
樣品準備
保持柱子長壽的關鍵是進樣前適當的的樣品處理。你必須防止將疏水性/與流動相極性差別很大的化合物泵入色譜柱,不管是來自流動相還是樣品。特別地,要禁止導入顆粒雜質。這些zui終都會造成操作壓力的增高而且非常困難或者不可能去除。
保護柱
一定要使用保護柱,因為樣品和洗脫液污染可能會造成柱壓力的增高而且影響選擇性。對于ChromSep 柱我們建議使用正確型號的ChromSep 保護柱。這個柱子的填充材料與用于分析的色譜柱的材料相似。當柱壓增高的或者觀察到柱效降低的時候就需要更換保護柱了。對于常用不銹鋼柱,我們建議使用相同型號的Chromguard High Efficiency()柱(10X3.0mm) 或High Capacity(高容量)柱(50X3.0mm)。
進樣量和濃度
柱子的zui大載樣量取決于:柱子的型號,使用的條件和樣品的類型。很難給出一個一般的指示。對于進樣體積的建議則比較容易(見表中的典型值)。
注射了太大體積或太濃的樣品會使峰展寬或者峰融合。
柱尺寸(長度*內徑)        zui大樣品體積        
250×2.0mm              ±10μl        
200×3.0mm              ±15μl        
250×4.6mm              ±50μl        
250×10.0mm            ±250μl        
溫度HPLC柱在柱溫箱中使用。重復性取決于溫度控制。*的溫度與特定的應用有關。溫度影響洗脫液流動的線速度。在使用ChromSep玻璃柱的時候,一定要調節流速使壓力保持在3000psi以下。
貯存
一定不要在柱子內充滿緩沖液或者其他含鹽類的洗脫液的情況下貯存色譜柱。 貯存溶劑應當含有至少20%的有機溶劑,以防止有細菌的生長。
柱效損失的可能原因
額外的峰展寬。當使用小直徑或者長度較短的柱子時,峰展寬的情況可能比較明顯。要保證管路的長度和內徑都保持zui小。檢查進樣體積和檢測器檢查池體積是否適用于柱體積。
洗脫的平衡時間不夠。
不正確柱溫。
不正確的修正濃度。
床壓縮。使用了過大的洗脫流速。將柱子反向,使用低流速。
柱效喪失和/或高背壓
顆粒物積聚在燒結物或者樹脂床上(它們都會使背壓增高)。如果柱壓增高了,將柱子與進樣器斷開,運行泵,以驗證背壓的來源確實是來自柱子的顆粒污染(樣品、洗脫液和系統)。倒轉柱子,以反向的流動來沖洗柱子。如果這樣不能解決問題,更換進口過濾器或者篩板。
微生物在洗脫液中生長。倒轉柱子,嘗試以反向的流動來將污染物沖洗出柱子。更換進口過濾器或者篩板。
有蛋白質脂肪,油脂污染或者極性化合物等污染。再生柱子(見第12節)。
再生
再生反相色譜柱
首先倒轉柱子。以大約*流速的40%的流速沖洗柱子大約45-60分鐘,使用的溶劑的順序要按照水—甲醇—異丙醇—二氯甲烷—異丙醇—甲醇—水進行。柱子轉回正常方向,使用分析所用洗脫液平衡。注意:在使用另外的淋洗方法的時候,一定要先用水開始沖洗以去除緩沖液,保證其后的洗脫液可以混溶。
再生硅膠柱
首先倒轉柱子。以大約*流速的40%的流速沖洗柱子大約45-60分鐘,使用的溶劑的順序要按照異辛烷(或己烷)—乙酸乙酯—干燥的異辛烷(或己烷)進行。柱子轉回正常方向,使用分析所用洗脫液平衡。
再生極性鍵合柱
取決于使用的條件,可以使用反相的條件,也可以使用硅膠柱的條件。
注意:不要使用酮類或醛類沖洗氨基柱,因為可能與固定相發生反應。四氫呋喃作為替代可以使用。

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